通过对制药用水系统的设计与控制，以降低微生物污染的风险

水源性微生物无处不在，在不同条件下的生存和生长能力各不相同。因此，失控的水系统可以导致药品微生物污染从而对患者造成伤害。需要对水进行净化，以防止与药物或产品配方中的其他成分相互作用，同时还必须对水进行微生物控制和监测，通过对制药用水系统的设计与控制，以降低微生物污染的风险。

化学和物理净水方法都基于强大的技术，在大多数情况下，该技术可以将污染物水平降低到百万分之一以下。这些方法的检测灵敏度在十亿分之一的范围内。

虽然化学分析通常能很快得出答案，以确保对问题做出快速反应，但微生物评估通常较慢且不太准确。虽然快速微生物方法正在逐步实施（如ATP生物发光或荧光DNA特异性染料），但大多数制药级用水的微生物评估都依赖于培养方法，这意味着生物负载结果要过几天才能得到（基于相当重视良好的设计原则）。

本文评估了良好设计的一些要求，以及维持制药设施水系统有效微生物控制所需的控制措施。

制药级用水

美国药典（USP）和/或欧洲药典（Ph.Eur.）中定义的制药用水有四个等级：饮用水（USP）、纯化水（USP和Ph.Eur.）、高纯化水（Ph.Eur.）和注射用水（WFI，USP和Eur.）。饮用水是其他等级的起始水；它不和产品直接接触。每个等级都有与生产方法、所需净化程度以及储存和分配过程有关的微生物问题。

纯化水通常通过反渗透生产，用于非无菌或无热原的配方（即不需要内毒素规范）。用途包括一些口服和外用产品，以及片剂和胶囊的造粒工艺。对于此类药物，关注的是整体生物负载和不存在“不可接受”的微生物：根据给药途径，这些微生物会对患者造成潜在伤害。纯化水也是WFI和制药级清洁蒸汽的原料。根据欧洲药典的要求，高纯度水用于制备眼科、鼻腔/耳朵、皮肤和其他药物。这种级别的水需要内毒素（每毫升<0.25个内毒素单位[EU]）和生物负载控制（每100毫升<10个菌落形成单位[CFU]）。

WFI是制药行业使用的最高质量的水；它是通过反渗透或蒸馏生产的（自2015年以来，根据美国药典和欧洲药典）。欧洲药典中规定了生物负荷和内毒素控制要求，即<10 CFU/100 mL（生物负荷）和<0.25 EU/mL（内毒素）。WFI用于制备胃肠外药物、透析和冲洗溶液，以及最高级别洁净室中的清洁试剂。

--

微生物的问题

对自来水公司或市政当局的饮用水进行监测，以确保化学污染物水平保持在既定的安全标准范围内，并对包括大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌和粪便大肠杆菌在内的微生物进行筛选。在大多数地区，供应给制药厂的水的质量都令人满意。然而，作为一种保护措施，许多药厂选择对水中的大肠杆菌等生物进行检测，作为粪便污染的标志。对现场饮用水进行处理、软化、净化（根据要求的等级）和分配。

虽然大多数设计良好的供水系统可以保持在受控状态，但微生物问题可能会发展。微生物粘附是细菌表面之间吸引和排斥的物理化学相互作用平衡的结果。主要问题是当微生物粘附在表面（如流速差的管道）时，会出现形成黏液状微生物群落，即生物膜。

生物膜的形成是因为细菌细胞一旦附着，就会分泌一种多糖-蛋白质复合物（水合聚合物黏液基质），它使每种细菌都能自我包裹在表面上；生物膜是随着这些生物的积累而形成的。步骤如图1：

（i）单个细胞填充表面（初始附着）

（ii）不可逆黏附

（iii）产生了聚合物外物质，附着物

（iv）不可逆转的

（v）生物膜结构的发展和成熟

（vi）随着时间的推移，单个细胞（或细胞团）从生物膜中释放出来

图1：生物膜的形成

这种类型的附着发生得相对较慢。各种因素会影响这一过程，包括所涉及的细菌类型、环境中细菌种群的大小及其生长阶段的持续时间。一般来说，革兰氏阴性菌更容易形成生物膜，部分原因是细菌细胞（菌毛）上的附属物使其更容易附着在表面。表面电荷是与细菌粘附有关的另一个重要现象。

生物膜中的微生物生长在源头处通常是很快的（图2）。然而，用户大体上的样本通常是零星的，因为随着时间的推移，生物膜的污染以不同的速率脱落。

图2：生物膜形成后，水系统中的微生物数量呈指数级增长

生物膜是水系统特别关注的问题，因为在水生环境中发现的细菌种群中，革兰氏阴性菌占大多数。此外，这些类型的生物体也会释放内毒素，这是细胞壁的一个组成部分。

制水过程的许多阶段，虽然设计目的是为了减少污染，但矛盾地为生物膜的形成创造了条件。一个例子是，通过基质进行深过滤。当水通过过滤器渗透时，微生物被吸附在基质上，形成复杂的群落。此外，纯化路径也会创造一系列不同营养丰富的繁殖环境。在这个过程的最后，营养物质基本上消耗到非常低的水平，从而产生了一个极端的环境。这种环境会激发微生物的极端应急反应，使它们更难以被消灭。

对于设计和维护适当的系统，纯化水和WFI的微生物污染风险较低。然而，无论何时检测到微生物（超过规范时），都会造成重大危险。

--

良好的设计原则

虽然制水的不同阶段都可以造成风险，但有许多设计和控制步骤可以减少微生物的繁殖。

（1）阻隔罐（Break tanks）

阻隔罐是微生物定植的第一个区域，它可以防止生产过程中产生的水重新进入供水系统。饮用水中的微生物附着在水箱的侧面和底部，形成生物膜。从罐中采集的样品通常符合饮用水的标准，并且不会立即反映正在积累的生物量。主要预防措施是定期维护和冲洗。

（2）活性炭吸附床

吸附床基质由细碳组成，在去除低分子量有机物质方面非常有效。它还可以氧化和去除氯等添加剂。它巨大的表面积和营养物质的积累，再加上氯的去除，可以导致微生物的快速定植和增殖。大多数生物体是革兰氏阴性菌，如果它们进行细胞裂解，会是内毒素的来源。控制整个供水系统的一个关键点是能够定期用热水或蒸汽对吸附床进行消毒，并经常更换。对于新的水系统，消毒应以更高的频率（如每周）开始；根据微生物负荷的趋势进行审查，随着时间的推移（每月）可以减少。评估生物负荷模式需要6个月至1年的数据。

（3）水软化剂

在有硬水的地区，需要使用软化剂来防止对去离子器和反渗透系统的干扰。当水通过树脂填充柱时，二价钙和镁阳离子被交换为钠离子。然而，树脂基质为潜在的微生物定殖提供了巨大的表面积。消毒和控制措施，如紫外线和氯气，对保持水质至关重要。

（4）去离子装置

标准去离子系统由带电树脂柱组成。可以分别用于阳离子和阴离子去除，或者可以使用混合床系统。去离子的优点是，这些柱可以用1摩尔（M）盐酸和1摩尔（M）氢氧化钠再生，这两者都有强杀灭性。如果再生频率较高，则该柱将保持在已消毒状态。未消毒的柱子或那些几天以上未再生的柱子与活性炭床存在同样的问题，即细菌生长的风险。

电去离子系统允许连续的柱再生，而不需要添加再生剂。它们易于维护，但也能促进细菌生长。反渗透膜可以过滤掉细菌，但如果维护不当，细菌可能会生长。当细菌细胞壁的碎片破裂时，内毒素可以很容易地穿过反渗透膜。

（5）存储和分配系统

设计不当的储存和配送系统为微生物的重新定植创造了机会，最终导致产品污染。定植通常很难检测，因为生物膜缓慢而随机地释放污染物（水中的微生物很少成正态分布，这意味着在辨别出总体趋势之前，微生物的数量可能会随着时间的变化而出现或消失）。

（6）储罐

储水箱通常由不锈钢制成。在使用时，确定内部表面的容量、使用率和清洗和消毒频率非常重要。定期保持水周转有助于防止污染；另一方面，周转缓慢会带来更大的潜在污染风险。储罐应通风，以控制水位波动。为了防止外部空气造成微生物污染，通风口应安装疏水性空气过滤器。这种过滤器还用于避免过滤器堵塞，从而造成真空条件并导致罐体内爆。应定期进行排气过滤器完整性测试（例如，每6个月或12个月进行一次）。

（7）储存温度

将WFI储存在循环不锈钢系统中是标准做法，尽管有时在对水要求极低矿物质含量时，会使用聚氯乙烯氟化物（PVDF）材质。在65ºC至80ºC的温度下运行的再循环系统是自我消毒的，但需要注意的是，应没有低于65ºC的冷点。纯化水系统可以热或冷。下文将更详细地讨论冷水系统的关键方面。

（8）管道和储罐设计

如果设计不当或维护不当，管道和水箱比水系统的任何其他部分都更有可能受到污染。设计良好的管道的一般要求是：

（i）光滑的内表面。微生物对光滑表面的粘附不如对粗糙表面的粘附好，因此耐腐蚀性和避免聚集（氧化铁的形成）很重要（可以通过不锈钢的电抛光来实现）。管道接头和焊缝也会破坏平滑度。

（ii）水箱中的水持续流动和管道中的水快速流动。已经发现，每秒1–2米的流速是令人满意的。这最大限度地减少了微生物粘附在表面（并形成生物膜）的机会。在发生剪切力的地方，微生物很难粘附在表面。在水静止的地方，就没有剪切力（剪切力随着流速的增加而增加）。

（iii）避免水可能保持停滞的地方（积水区域）。如果支管太长，主管上的湍流无法扰动支管，水可能会停滞在"死角"中（图3）。原则尽量减少支管的长度。水也可能在阀门中保持停滞状态，尤其在用水点，如那些不经常使用的阀门。这可以通过卫生或"零死角"阀门来抵消，比其他阀门（如球阀）要好得多。死角的存在将导致生物膜的形成，从而产生内毒素释放。正确的排水坡度也可以降低污染风险。循环管路应从起点到回路倾斜（"下降"），以确保系统完全可排空。

（iv）避免泄漏。漏水会导致水与外部环境接触，外部环境的细菌可以通过漏水点进入系统。储罐的通风口应配备过滤器，以防止空气传播的微生物进入。它们甚至可以通过氮气等惰性气体的“包裹”下进入。

（v）高温储存和分配。尽管在上述控制方面进行了最佳尝试，但内毒素脱落生物膜的风险被认为具有如此重大的影响，以至于大多数制造商要求储存和分配温度保持在65°C以上。如果制造商有足够的数据来证明较低的温度工作正常，则较低的温度也可以接受。

然而，对于大多数药物制剂而言，65°C的温度过高。这意味着用户通常配备有某种形式的冷却机制。应该注意的是，用于此目的的热交换器可能是内毒素和细菌污染的来源，因此可能抵消高温循环的许多好处。

（vi）在适当的情况下（为了不造成浸出有毒物质的风险），在管道和储罐表面上使用涂层有助于解决生物污染问题。

图3：设计不良的输水管道，死角

（9）冷水系统

净化水系统通常使用臭氧、紫外线和在线过滤器来限制微生物数量，而不是高温。需要考虑的要点是：

（i）臭氧被定期用于消毒。它攻击微生物的外表面，破坏细胞壁和细胞膜。

（ii）紫外线不是消毒剂，虽然它可以降低微生物的数量。效率取决于路径长度、流速和光源的使用年限。在制药水处理系统中，最常用来降低微生物数量的波长是254纳米。紫外线对于催化用作消毒剂臭氧或过氧化氢的分解也非常有用，尽管其功效经常因维护不善或灯故障而减弱。

（iii）过滤器是定植的理想基质，需要仔细监测压差，并经常进行消毒或更换。如果过滤器上形成了生物膜，消毒会杀死生物膜内的大多数微生物，但可能不会去除基质，基质可能会迅速重新定植。此外，种群中存在的高抗性“持久细胞”将不受影响并再生。

（iv）冷水系统通常使用热塑性材料，因为它们比不锈钢（在低温下）遭受的生物污垢更少。用于建造管道的塑料材料通常是聚丙烯或聚偏氟乙烯。

（v）管道工程中的弯曲应尽可能平缓且尽可能少；水龙头的数量应保持在最小值。任何对水流顺畅的破坏都会导致湍流，这为循环微生物粘附在可定植表面创造更多机会，从而导致生物膜的形成。

（10）供水点

生产区的供水点包括通过输送管道（或管道）将水从循环水回路输送到使用点，输送管道应由合适的无毒材料制成，如聚氯乙烯（PVC）、氯化聚氯乙烯、聚丙烯或聚偏氟乙烯。输送管道应在使用后排水，并定期更换（如每24小时更换一次）；必须小心避免水槽溅回或气溶胶再次污染。安装新卡套管之前应进行消毒；在使用之前（在规定的时间或给定的水量内）冲洗管道和出口也是常见的。采取这些措施是为了避免在输送过程中对水造成污染。

--

当出现错误情况时

水系统控制的丧失和微生物污染可能有多种原因，包括树脂老化、过滤器老化、紫外线灯维护不善、维护不当、无法实现有效的热分布、泄漏（如热交换器）、死管段和水系统改造（如切断管道）。

有多种选择可用于处理和改善水质。选择的方法取决于微生物恶化的原因、问题的来源、所需的水质、待处理的水量和分配系统的类型。系统设计会影响微生物种群的大小和清除能力。死管、通往水龙头的长管道、无法排水的管道和U型弯管也会造成微生物问题。

通常使用四种方法来去除微生物污染：加热、化学物质、过滤或紫外线。处理时间对每个方法来说都很重要。

如前所述，加热可用于维持在65°C至80°C的热水系统的循环回路中（≥75°C为最佳）。如果这被证明是不够的，那么应该有过热系统的能力（将温度升高到121°C一小时或更长时间）。

化学处理（如臭氧、氯、二氧化氯、过氧化氢、过乙酸和氢氧化钠）适用于原水，但也可用于处理蒸馏、去离子和反渗透产生的水的分配系统。所用化学品的浓度取决于配水系统中水的位置。例如，如果达到每升游离氯0.2毫克的最低水平，氯化通常是有效的。接触时间会随着水温和pH值的变化而变化；0.2mg/L游离氯的典型时间在30到60分钟之间。重要的是，任何添加的化学物质都必须在某个时候去除。

使用0.22微米（μm）多孔过滤器的膜过滤适用于使用量适中且可以保持连续水循环的情况（即，水不断返回储罐并重新过滤，但抽出使用的水除外）。虽然过滤原理上运行良好，但对于高吞吐量来说，它相对昂贵，因为它们需要定期更换以防止堵塞和“渗透”。因此，使用0.22μm过滤器来控制产品制造用水的污染是不受欢迎的。过滤器只能在分发过程之前使用。

紫外线辐射（254nm）用于消毒具有良好光学清晰度的水；它在多灯系统的再循环水系统中工作得特别好。虽然接触时间因剂量和流速而异，但通常在1至10秒的范围内。需要这段时间才能让紫外线穿透水，并与任何存在的细菌接触。

微生物监测

频繁的监测对于验证微生物控制非常重要。这涉及生物负荷评估，通常使用带有膜过滤的微生物计数方法，并选择低营养琼脂（如R2A）作为培养基。在适用的情况下，还建议用鲎试剂进行细菌内毒素检查。在这两种情况下，行动或警戒限值都必须基于验证数据，并且必须设置得足够低，以表明正常操作条件发生了重大变化。

结论

在制药配水系统中，微生物粘附会引发生物膜的形成，加剧水的污染，降低饮用水的美观质量，增加管道的腐蚀率，并通过增加病原体的存活率来降低微生物安全性。因此，微生物控制是工程师、生产人员和微生物学家关注的问题。

本文概述了水系统的微生物学，并概述了制药级用水的设计、控制和生成。虽然已经讨论了设计和控制的几个方面，但可能最重要的两个方面是避免积水（这总是污染源），以及在水系统的每个步骤都有消毒规定。